Metagenom (16S/18S/ITS) Dizileme Hizmeti

Metagenom (16S/18S/ITS) Dizileme Hizmet Tanımı

Doğal mikroorganizmaların %99’undan fazlası izole edilemez ve klonal olarak kültürlenemezken, geleneksel izolasyon ve kültüre bağlı yöntemler, mikroorganizmaların doğal ortamlarında incelenmesine meydan okur.

Doğrudan çevresel örneklerden geri kazanılan genetik materyalin metagenomik çalışmaları, mikrobiyal biyoçeşitliliğin araştırılması için bir yöntem olarak gelişmiş NGS teknolojisinden büyük ölçüde faydalanmıştır. 16S ve 18S rDNA, bakteri ve mantardaki 16S veya 18S rRNA genlerinde hiperdeğişken bölgelerdir, ITS (Internal Transcribed Spacer) ise bakteriler, mantarlar ve arkelerdeki küçük alt birim ve büyük alt birim rRNA genleri arasındaki ayırıcı DNA’dır.

16S / 18S / ITS bölgelerinin sekans karşılaştırması, çok yakın akraba türler arasında bile yüksek derecede varyasyona sahipken, düşük DNA miktarlarından bile PCR ile kolay çoğaltılması nedeniyle taksonomi ve moleküler filogenide yaygın olarak kullanılmaktadır.

Metagenom Dizileme

1. DNA İzolasyonu

Öncelikle çalışmak istediğimiz organizmanın dokusuna ait numuneden DNA izole edilmelidir. Bunun için numune materyaline göre özel izolasyon kitleri kullanılır. Daha sonra elde edilen DNA’nın kalitesinin ölçümü “Qubit” cihazı ile yapıldıktan sonra bir sonraki adım olan fragmantasyon aşamasına geçilebilir.

2. Fragmantasyon

Nitelikli DNA örnekleri, numune kalitesinden (QC) sonra enzimatik olarak rastgele parçalanır. Parçaların uzunlukları, ileride yapılacak olan dizileme aşamasında çift veya tek yönlü okuma uzunluğuna göre hesaplanmalı ve çalışma için özel olarak optimize edilmelidir. Bu fragmanların kalite kontrolü “Bioanalyzer” cihazı ile yapılmaktadır.

3. Kütüphane Hazırlığı

Manyetik boncuklarla toplanan bu DNA parçalarının uçları onarılır (son onarım) ve 3′ uçlarına adenin eklenir. Bir sonraki adımda ligasyona temelli olarak fragmanlara adaptörler ve barkodlar eklenir ve ilk PCR adımı başlatılır.

4. Köprü Amplifikasyonu

16S/18S ve ITS dizileme için illumina platformu kullanılmaktadır. Uzun okumalardan yararlanılarak identifikasyon konusunda avantaj sağlanır. Illumina tabanlı dizileme teknolojisi, köprü amplifikasyonu metoduna dayanır.

Fragmanlar; kütüphane aşamasında eklenen adaptör diziler yardımıyla, katı yüzeye sabitlenmiş komplementer oligolara hibridize olur. Ardından sıcaklık değişimi ile fragman bükülür ve diğer uçtaki adaptör, çip yüzeyindeki komplementer oligoya hibridize olur. Bu işlem tekrarlanarak yüksek sayıda amplifikasyon elde edilir ve böylece sinyal seviyesi yükseltilmiş olur.

5. Dizileme Adımı

Flow cell üzerinde gerçekleşen amplifikasyon sırasında açığa çıkan ışımalar cihaz tarafından tespit edilir ve kaydedilir. Böylece fragmanların dizisi çıkarılmış olunur. Daha sonra bu diziler biyoenformatik analiz aşamasında birleştirilerek, anlamlı hale getirilir.

Sekans Süreci

  • Primer bağlama ve dizileme solüsyonunun akış hücresine yüklenmesi
  • Primer sonrası bazın bağlanması
  • Görüntüleme
  • Ayrılma
  • Ortamdaki bağlı olmayan bazların kaldırılması

Dizileme Teknolojisi

Çok çeşitli uygulamalar için son derece doğru veriler ve güçlü performans sağlamak için kanıtlanmış SBS teknolojisini kullanılır. SBS, büyüyen DNA ipliklerine dahil edildiklerinde tek bazları tespit etmek için floresan etiketli nükleotidler ile tersine çevrilebilir bir sonlandırıcı yöntem kullanılır.

Çift uçlu dizileme, DNA parçasının her iki ucunun dizilenmesini sağlar. Her bir eşleştirilmiş okuma arasındaki mesafe bilindiğinden, hizalama algoritmaları bu bilgileri okumaları haritalamak için kullanabilir. Bu, özellikle dizilmesi zor, genomun tekrarlayan bölgelerinde faydalıdır.

8. Biyoenformatik Analiz

Temiz okumaları elde etmek için ilk önce, düşük okuma değerlerininin, adaptör okumaları, bilinmeyen bazların okumaların (N bazları% 5’ten fazla) filtrelenmesi yapılır. Daha sonra kümeleme analiziyle, çoklu örneklemlere dayalı karmaşıklığı değerlendirmek için kullanılır.

Türler, bir tür profili profilleme histogramı, ısı haritası ve bir filogeni ağacının sağlanmasına dayalı olarak OTU ek açıklamasına göre sınıflandırılır. Tek bir örnekte alfa çeşitlilik indeksleri oluşturulur Birden fazla örnek için beta çeşitliliği ve kümeleme analizi yapılır. Karşılaştırmalı analiz, çoklu numunelerdeki önemli farklılıkları taramak için kullanılır.

Çalışılan örnekler PE300 protokolü ile okunduğundan dolayı, identifikasyon diğer protokollere göre daha kolay olur. Seçilen sıralama stratejisine bağlı olarak ≥Q30 kalite puanına sahip bazların ≥% 80’ine kadar sıralama kapsamı elde edilebilir.

Metagenom Dizileme

Bizimle İletişime Geçmek İster Misiniz?