Yeni Nesil Dizileme

Moleküler genetik çalışmalarında sıklıkla başvurulan yöntemlerden biri DNA/RNA dizilemedir. DNA dizi analizi yapmak için biraz daha geleneksel yöntemlerden biri olan Sanger Dizileme kullanılabileceği gibi, NGS (Yeni Nesil Dizileme) yöntemleri de kullanılabilmektedir.

Sanger Dizileme veya Yeni Nesil Dizileme arasındaki en büyük fark, okuma miktarlarıdır. Sanger dizileme ile tek run ile ortalama olarak 700 bp okuma yapılabilirken, NGS yöntemleri ile milyarlarca baz çifti uzunluğundaki genomları oldukça kısa sürelerde dizilemek mümkündür.

High Throughput Sequencing olarak da bilinen NGS sistemleri, klinikten araştırmaya kadar pek çok alanda kullanım için uygundur. Klinikte tek bir geni dizileme, belli hastalıklardan sorumlu olabilecek genlere ait panelleri dizileme veya tüm ekzom dizileme gibi pek çok noktada tercih edilmektedir. Çoğu zaman uzun dizilerin okunması konusunda avantaj sağlamasından kaynaklı olarak, Sanger dizileme yerine tercih edilmesine karşın, NGS sonuçlarının doğrulanması için çoğu zaman mutasyonlu bölgenin Sanger dizileme ile konfirmasyon da yapılabilmektedir.

Yeni Nesil Dizileme
Yeni Nesil Dizileme

Jenerasyon

Klinikte veya projede kullanılacak NGS yöntemi belirlenirken dikkat edilmesi gereken noktaların başında, kaçıncı nesil yönteme ihtiyaç olduğudur. 2. nesil sistemler görece 3. nesil yöntemlere göre çok daha ucuz fiyat sunabilirken, de novo projelerde veya SV (structural variant) ve CNV (copy number variation) tespitinde 3. nesil yöntemler çok daha büyük avantajlar sağlamaktadır. De Novo Assembly konusunda referans genomun çıkarılması için 3. nesil sistemler kullanılırken, referans genoma hizalayıp yüksek okuma derinliği elde etmek için 2. nesil sistemler ile kısa okumalar yapılır.

Q Skoru (Phred Quality Score)

Phred kalite puanları, DNA dizilerinin kalitesini karakterize etmek için geniş çapta kabul görmüştür ve farklı dizileme yöntemlerinin etkinliğini karşılaştırmak için kullanılabilir. Phred kalite puanlarının belki de en önemli kullanımı, doğru, kaliteye dayalı fikir birliği dizilerinin otomatik olarak belirlenmesidir .

Phred Kalite Puanı  Yanlış Baz Arama Olasılığı  Baz Arama Doğruluğu
10 10’da 1 90%
20 100’da 2 99%
30 1.000’da 3 99,9%
40 10.000’da 4 99,99%
50 100.000’da 5 99,999%
60 1.000.000’da 6 99,9999%

Yeni nesil dizileme sistemlerinde genel olarak, okuma uzunluğu arttıkça Q skoru (Phred Quality Score) ters yönde hareket ederek, düşüş gösterir. Bu durum, okuma derinliğinden kaynaklanmaktadır. Aynı data miktarlarında çift yönlü 2.000 bp okuma ile çift yönlü 100 bp okumadaki Phred kalite skoru arasında ciddi farklılıklar olabilir. Phred kalite skoru sadece okuma uzunluğundan değil, kullanılan NGS sisteminin teknolojisiyle de alakalı olabilmektedir.

Okuma Uzunluğu

Dizil analizi yapılacak olan moleküllerin boyutu da NGS hizmeti alırken dikkat edilmesi gereken bir başka noktadır. Örneğin miRNA gibi genellikle 50 nükleotitten kısa moleküllerin dizilemesi için 50 baz çifti uzunluğunda dizilemeyi içeren bir hizmet alınması gerekirken, aynı hizmet 200 nükkeotitten daha uzun olabilen mRNA ve lncRNA’lar için uygun olmayacaktır.

Klinik çalışmalarda da okuma uzunluğu önem taşımaktadır. Nitekim uzun okumalarda SV ve CNV tespiti daha kolay yapılabilmektedir. Yapısal varyantların ve kopya sayısının reel mi yoksa kopya okuma mı olduğunu anlama konusunda uzun okumalar, kısa okumalara göre analiz aşamasında daha fazla yardımcı olabilmektedir.

Kaynaklar

  1. Ewing B; Hillier L; Wendl MC; Green P. (1998). “Base-calling of automated sequencer traces using phred. I. Accuracy assessment”. Genome Research. 8 (3): 175–185. doi:10.1101/gr.8.3.175. PMID 9521921.