PacBio Dizileme Hizmeti

PacBio Dizileme Hizmet Tanımı

Pacific Biosciences (PacBio) tarafından geliştirilen “İzoform Dizileme” (Iso-seq), uzun okunan dizileme teknolojisine dayanmaktadır. Benzersiz uzun okumalı sıralama özelliği, bu yöntemin yeni izoformları olağanüstü hassasiyetle tanımlamasına olanak tanır.

Genellikle daha önce genomu çıkarılmamış veya referans genomu bulunmayan canlılar için kullanılan PacBio, de novo genom dizileme çalışmalarında referans genomu elde etme konusunda büyük kolaylıklar sağlamaktadır.

PacBio yalnızca genom çalışmalarında kullanılmamaktadır. Iso-Seq uygulaması, transkriptlerin 5′ ucundan poli-A kuyruğuna kadar tam uzunlukta cDNA dizileri üretir ve izoform çıkarım algoritmalarını kullanarak transkriptom rekonstrüksiyonu ihtiyacını ortadan kaldırır. Iso-Seq yöntemi, alternatif olarak eklenmiş eksonlar ve transkripsiyonel başlangıç ​​siteleri hakkında doğru bilgi sağlar. Aynı zamanda, hedeflenen genler veya tüm transkriptom içindeki izoformların tam tamamlayıcısı boyunca transkriptler için poli-adenilasyon siteleri hakkında bilgi verir.

PacBio

1. DNA İzolasyonu

Öncelikle çalışmak istediğimiz organizmanın dokusuna ait numuneden DNA izole edilmelidir. Bunun için numune materyaline göre özel izolasyon kitleri kullanılır. Daha sonra elde edilen DNA’nın kalitesinin ölçümü “Qubit” cihazı ile yapıldıktan sonra bir sonraki adım olan fragmantasyon aşamasına geçilebilir.

2. Fragmantasyon

Nitelikli DNA örnekleri, numune kalitesinden (QC) sonra enzimatik olarak rastgele parçalanır. Parçaların uzunlukları, ileride yapılacak olan dizileme aşamasında çift veya tek yönlü okuma uzunluğuna göre hesaplanmalı ve çalışma için özel olarak optimize edilmelidir. Bu fragmanların kalite kontrolü “Bioanalyzer” cihazı ile yapılmaktadır.

3. Kütüphane Hazırlığı

Manyetik boncuklarla toplanan DNA parçalarının uçları onarılır (end repair) ve 3’ uçlarına adenin eklenir. Bir sonraki adımda, fragmanlara ligasyon temelli olarak adaptörler ve barkodlar eklenir. Bağlanmamış fragmanlardan kurtulmak için ilk PCR adımından sonra saflaştırma yapılır, saflaştırmadan sonra ikinci PCR başlatılabilir. Standart teknolojilerin aksine, bu ikinci PCR aşaması, DNA’yı “daireselleştirme” adı verilen bir aşama ile yuvarlak bir zincire dönüştürerek aynı zincir üzerinde DNA Nanoball (DNB) oluşturur ve böylece PCR hatalarını en aza indirir. Bir atel oligo da DNA’yı dairesel hale getirmek için kullanılır.

4. Dizileme Adımı

Oluşturulan her bir DNB, DNBSEQ G-400 dizileme platformundaki akış hücresindeki (Pattern Array) noktalara yerleştirilir. Akış hücresinde (Flow Cell) sekans işlemi gerçekleşir. Klasik dizileme yönteminde olduğu gibi, farklı boyalarla işaretlenmiş modifiye edilmiş dNTP’leri içeren reaksiyon çözeltisi akış hücresine yüklenir. DNBSEQ G-400 cihazı, cPAS veya CoolMPS teknolojisini kullanarak her Nanoball’daki bazların okunmasını sağlar.

Sekans Süreci

  • Primer bağlama ve dizileme solüsyonunun akış hücresine yüklenmesi
  • Primer sonrası bazın bağlanması
  • Görüntüleme
  • Ayrılma
  • Ortamdaki bağlı olmayan bazların kaldırılması
PacBio

Dizileme Teknolojisi

Dört ayırt edilebilir floresan etiketli deoksiribonükleosit trifosfat (dNTP’ler) kullanarak kesintisiz şablona yönelik sentez gerçekleştiren bir DNA polimerazdan elde edilen tek moleküllü, gerçek zamanlı dizileme verilerini sunulmaktadır.

Sekans verileri, her şablon pozisyonu için polimerizasyonun biyofiziksel parametrelerini denemek için bilinen referans sekans ile hizalandı. Florofora bağlı hata oranlarının ötesinde hiçbir sistematik hata olmaksızın %99,3’lük bir medyan doğruluk gösteren 15 kat kapsama alanıyla tek moleküllü okumalardan konsensüs dizileri oluşturulur.

5. Biyoenformatik Analiz

Biyoinformatik analiz, sekanslama sonucunda üretilen ham verilerle başlar. Verilerin anlamlı hale getirilmesi ile, grup içi örneklerin karşılaştırılması, deneydeki örneklerin veri tabanları ile karşılaştırılması, popülasyonlara göre dağılımı gibi analizleri içerir.

Filtreleme

İlk başta, bu okumalardan adaptör okumaları ve düşük kaliteli okumalar çıkarılır. Bundan sonra ortaya çıkan verilere temiz veri denilir.

  • % 50'den fazla adaptör sekansına sahip okumalar atılır.
  • Bazlarının % 50'sinden fazlası için Phred Değeri 20'den az olan düşük kaliteli okumalar atılır.
  • % 2 veya daha fazla "N" içeren okumalar atılır.

Hizalama

Okumalar daha sonra Burrows-Wheeler Aligner (BWA) ile referans genom ile hizalanır. Hizalama sonucunda oluşturulan SAM (Squence Aligned Map) dosyaları BAM (Binary Aligned Map) formatına dönüştürülerek bu formda saklanır ve oluşturulan SAM dosyaları silinerek yer tasarrufu sağlanır. Oluşturulan veriler üzerinde gerekli filtreler (Picard Tools) yapılır ve duplike okumalar işaretlenir. Bu adımdan sonra, BAM dosyaları varyant tespiti için hazırdır.

  • Referans genoma dayalı indeksleme yapılır.
  • Okumalar referans genom ile karşılaştırılır ve hizalamayla ilgili koordinat bilgileri bulunur.
  • Hizalamadaki koordinat bilgileri SAM dosyasına dönüştürülür ve ardından SAM dosyalarını BAM dosyalarına dönüştürülür.

SNP ve InDel Analizi

SNP’ler ve In Del tespitleri GATK4 ile işlenir ve açıklama ve sınıflandırma için Genoks tarafından geliştirilen bir analiz aracı kullanılır.

SV Analizi

Yapısal varyasyonlar, çift uçlu okumaları hizalarken genel SV analizini zorlaştırır, bu nedenle bu anormal okuma çiftlerini ve/veya SV’leri çağırmak için yumuşak klip okumaları kullanılır. Burada kullanılan analiz aracı Break Dancer’dır.

Kopya Sayısı (CNV) Analizi

Varyantların sonuçlarının anotasyonu, VEP ve ANNOVAR aracılığıyla yapılır.

  • DNA dizileri, hizalama sonuçlarına göre bazların dizi derinliğine göre bölümlere ayrılır.
  • P değeri, her bir parçanın bir CNV olma olasılığını tahmin etmek için hesaplanır.
  • Kriterleri geçen fragmanlar (2 kb'den uzun parça uzunluğu, P değeri <= 0,35 ve ortalama derinlik 0,5'ten az veya 2,0'dan büyük) CNV olarak tanımlanır.
PacBio
PacBio

Bizimle İletişime Geçmek İster Misiniz?