Small RNA Dizileme Hizmeti
Small RNA Dizileme Hizmet Tanımı
Küçük RNA’lar, uzunluğu 200nt’den daha az olan bir tür kodlamayan RNA (ncRNA) molekülüdür. Genellikle gen susturma ve gen ekspresyonunun transkripsiyon sonrası düzenlenmesinde yer alırlar.Küçük RNA dizilimi, yeni küçük RNA’ları keşfetmek, tüm küçük RNA’ların farklı ifadelerini incelemek ve tek tabanlı çözünürlükle varyasyonları karakterize etmek için kullanılır.
Başlangıçtan sonuç raporlamasına kadar numunelerinize özen gösteriyoruz. Son derece deneyimli laboratuvar uzmanları, sonuçlarınızın bütünlüğünü sağlamak için sıkı kalite prosedürlerini takip eder.
miRNA sıralama projeniz için bir dizi standart ve özelleştirilmiş biyoinformatik pipe line sunar. Raporlar ve çıktı veri dosyaları, yayına hazır tablolar ve şekillerle endüstri standardı FASTQ ve Excel dosya formatlarında sunulur.
1. Total RNA İzolasyonu
Çalışılmak istenen canlı dokusundan total RNA izolasyonu yapılmalıdır. Örnek canlıya ve bu canlının hedef dokusuna göre özel izolasyon kitleri kullanılabilir. Daha sonra elde edilen RNA’nın kalitesi, Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent RNA 6000 Nano Kit) kullanarak tespit edilir.2. Boyut Seçimi
miRNA dizileme için agaroz jel elektroforezi ile small RNA moleküleri ayrıştırılır ve elde edilen RNA’lar ile bir sonraki aşama olan kütüphane aşamasına geçilir.3. cDNA Sentezi
Bölünmüş RNA fragmanları, ters transkriptaz ve rastgele primerleri kullanarak tek zincirli cDNA’ya çevirilir. Bunu DNA Polimeraz I ve RNase H kullanarak ikinci iplikçik cDNA sentezi izler.4. Kütüphane Hazırlığı
Manyetik boncuklarla toplanan bu DNA parçalarının uçları onarılır (son onarım) ve 3′ uçlarına adenin eklenir. Bir sonraki adımda ligasyona temelli olarak fragmanlara adaptörler ve barkodlar eklenir ve ilk PCR adımı başlatılır.5. Daireselleştirme
Standart teknolojilerin aksine, ikinci PCR aşaması, DNA’yı “daireselleştirme” adı verilen bir aşama ile yuvarlak bir zincire dönüştürerek aynı zincir üzerinde DNA Nanoball (DNB) oluşturur ve böylece PCR hatalarını en aza indirir. DNA’yı dairesel hale getirmek için bir splint oligo da kullanılır.6. Dizileme Adımı
Oluşturulan her bir DNB, DNBSEQ G-400 dizileme platformundaki akış hücresindeki (Pattern Array) noktalara yerleştirilir. Akış hücresinde (Flow Cell) sekans işlemi gerçekleşir. Klasik dizileme yönteminde olduğu gibi, farklı boyalarla işaretlenmiş modifiye edilmiş dNTP’leri içeren reaksiyon çözeltisi akış hücresine yüklenir. DNBSEQ G-400 cihazı, cPAS veya CoolMPS teknolojisini kullanarak her Nanoball’daki bazların okunmasını sağlar.
Sekans Süreci
Dizileme Teknolojisi
cPAS dizileme teknolojisi, DNB üzerindeki DNA’ya floresansla modifiye edilmiş dNTP ekleyerek yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme prensibi üzerinde çalışır. CoolMPS dizileme teknolojisinde, dizileme floresan dNTP’ler ile değil, özel olarak tasarlanmış “antikorlar” ile yapılır. Her iki sekanslama teknolojisinde de sinyalizasyon artarken hata oranı azaltılır. DNBSEQ G-400 cihazında aynı anda 2 çip (Flow Cell) çalıştırarak, okumaya göre maksimum 1440 Gb (1,4TB) ‘ye kadar değişken ve yüksek veri çıkışı verebilir. Ortalamada; Araştırma amaçlı tüm genom sekanslama çalışmaları için 10X sekanslama derinliği yeterliyken, klinik tanı gerektiren bir çalışma için >30X sekanslama derinliği önerilir.
8. Biyoenformatik Analiz
Temiz okumaları elde etmek için ilk önce, düşük okuma değerlerininin, adaptör okumaları, bilinmeyen bazların okumaların (N bazları% 5’ten fazla) filtrelenmesi yapılır. Daha sonra bu temiz okumaları referans genomla karşılaştırıp ardından yeni gen tahmini, SNP & INDEL ve gen ekleme tespiti yapılır. Son olarak, örnekler arasındaki farklı şekilde ifade (eksprese) edilmiş genleri tespit edilir ve kümeleme analizi ve işlevsel ek açıklamalar yapılır.Small RNA Dizileme Prosedürü
Küçük RNA, organizmalarda gen sessizliğini indükleyen ve önemli bir rol oynayan özel bir molekül türüdür. Hücre büyümesinin düzenlenmesi, gen transkripsiyonu ve çevirisi. Yüksek verimli dizilemeye dayanan küçük RNA dijitalizasyon analizi, SBS dizilemesini sentez yoluyla alır ve bu, neden olduğu nükleotid kaybını azaltabilir. Aynı zamanda, küçük numune miktarı gereksinimi, yüksek verim, yüksek doğruluk için de güçlüdür.