stLFR Dizileme Hizmeti

stLFR Dizileme Hizmet Tanımı

İnsan genomunu daha yüksek çözünürlükte ve daha iyi kalitede sorgulamak için standart NGS iş akışı, özellikle karmaşık Yapısal Varyasyon (SV) keşfi için, kesme noktalarında yetersiz okuma kapsamı ve uzun menzilli genomik yakınlık kaybı nedeniyle zorlanmaktadır.

Tek Tüplü Uzun Parça Okuma (stLFR) teknolojisi, yeniden üretilebilirliği ve tutarlılığı korurken, yüksek fikir birliği doğruluğu, tek tip kapsam ve üstün SV algılama özelliği ile 10 kb’den daha uzun okumalar üretir. Küçük bir miktar giriş HMW genomik DNA’sı ile (1 ng kadar düşük, yaklaşık 300 genomik eşdeğer), gDNA moleküllerinin barkodlandığı ve rastgele priming ve polimeraz amplifikasyonuna tabi tutulduğu 30 milyon barkodlu boncuk içeren tek bir tüpe eklenir. Ortak barkodlu DNA fragmanları daha sonra serbest bırakılır ve ardından değiştirilmiş bir kütüphane hazırlama işlemi yapılır. Elde edilen kitaplıklar, DNA Nanoball (DNB ™) üretimine ve DNBSEQ dizilemesine tabi tutulur. BGI’nin tescilli hesaplama algoritması, sıralama okumalarını orijinal HMW DNA molekülüne birleştirmek için barkodları kullanır.

stLFR Dizileme

1. DNA İzolasyonu

Öncelikle çalışmak istediğimiz organizmanın dokusuna ait numuneden DNA izole edilmelidir. Bunun için numune materyaline göre özel izolasyon kitleri kullanılır. Daha sonra elde edilen DNA’nın kalitesinin ölçümü “Qubit” cihazı ile yapıldıktan sonra bir sonraki adım olan fragmantasyon aşamasına geçilebilir.

2. Fragmantasyon

Nitelikli DNA örnekleri, numune kalitesinden (QC) sonra enzimatik olarak rastgele parçalanır. Parçaların uzunlukları, ileride yapılacak olan dizileme aşamasında çift veya tek yönlü okuma uzunluğuna göre hesaplanmalı ve çalışma için özel olarak optimize edilmelidir. Bu fragmanların kalite kontrolü “Bioanalyzer” cihazı ile yapılmaktadır.

3. Kütüphane Hazırlığı

Manyetik boncuklarla toplanan DNA parçalarının uçları onarılır (end repair) ve 3’ uçlarına adenin eklenir. Bir sonraki adımda, fragmanlara ligasyon temelli olarak adaptörler ve barkodlar eklenir. Bağlanmamış fragmanlardan kurtulmak için ilk PCR adımından sonra saflaştırma yapılır, saflaştırmadan sonra ikinci PCR başlatılabilir. Standart teknolojilerin aksine, bu ikinci PCR aşaması, DNA’yı “daireselleştirme” adı verilen bir aşama ile yuvarlak bir zincire dönüştürerek aynı zincir üzerinde DNA Nanoball (DNB) oluşturur ve böylece PCR hatalarını en aza indirir. Bir atel oligo da DNA’yı dairesel hale getirmek için kullanılır.

4. Bisülfit Muamelesi

Bisülfit ile muamele için “ZYMO EZ DNA Methylation-Gold” gibi piyasada mevcut kitler kullanılabilir. Kullanım için kit protokolünden yararlanılabilir. Bisülfit muamelesinden sonra PCR ile amplifikasyon yapılır.

5. Dizileme Adımı

Oluşturulan her bir DNB, DNBSEQ G-400 dizileme platformundaki akış hücresindeki (Pattern Array) noktalara yerleştirilir. Akış hücresinde (Flow Cell) sekans işlemi gerçekleşir. Klasik dizileme yönteminde olduğu gibi, farklı boyalarla işaretlenmiş modifiye edilmiş dNTP’leri içeren reaksiyon çözeltisi akış hücresine yüklenir. DNBSEQ G-400 cihazı, cPAS veya CoolMPS teknolojisini kullanarak her Nanoball’daki bazların okunmasını sağlar.
stLFR Dizileme

Sekans Süreci

  • Primer bağlama ve dizileme solüsyonunun akış hücresine yüklenmesi
  • Primer sonrası bazın bağlanması
  • Görüntüleme
  • Ayrılma
  • Ortamdaki bağlı olmayan bazların kaldırılması

Dizileme Teknolojisi

cPAS dizileme teknolojisi, DNB üzerindeki DNA’ya floresansla modifiye edilmiş dNTP ekleyerek yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme prensibi üzerinde çalışır. CoolMPS dizileme teknolojisinde, dizileme floresan dNTP’ler ile değil, özel olarak tasarlanmış “antikorlar” ile yapılır. Her iki sekanslama teknolojisinde de sinyalizasyon artarken hata oranı azaltılır. DNBSEQ G-400 cihazında aynı anda 2 çip (Flow Cell) çalıştırarak, okumaya göre maksimum 1440 Gb (1,4TB) ‘ye kadar değişken ve yüksek veri çıkışı verebilir.

6. Biyoenformatik Analiz

Biyoinformatik analiz, sekanslama sonucunda üretilen ham verilerle başlar. Verilerin anlamlı hale getirilmesi ile, grup içi örneklerin karşılaştırılması, deneydeki örneklerin veri tabanları ile karşılaştırılması, popülasyonlara göre dağılımı gibi analizleri içerir.

Filtreleme

İlk başta, bu okumalardan adaptör okumaları ve düşük kaliteli okumalar çıkarılır. Bundan sonra ortaya çıkan verilere temiz veri denilir.

  • % 50'den fazla adaptör sekansına sahip okumalar atılır.
  • Bazlarının % 50'sinden fazlası için Phred Değeri 20'den az olan düşük kaliteli okumalar atılır.
  • % 2 veya daha fazla "N" içeren okumalar atılır.

Hizalama

Okumalar daha sonra Burrows-Wheeler Aligner (BWA) ile referans genom ile hizalanır. Hizalama sonucunda oluşturulan SAM (Squence Aligned Map) dosyaları BAM (Binary Aligned Map) formatına dönüştürülerek bu formda saklanır ve oluşturulan SAM dosyaları silinerek yer tasarrufu sağlanır. Oluşturulan veriler üzerinde gerekli filtreler (Picard Tools) yapılır ve duplike okumalar işaretlenir. Bu adımdan sonra, BAM dosyaları varyant tespiti için hazırdır.

  • Referans genoma dayalı indeksleme yapılır.
  • Okumalar referans genom ile karşılaştırılır ve hizalamayla ilgili koordinat bilgileri bulunur.
  • Hizalamadaki koordinat bilgileri SAM dosyasına dönüştürülür ve ardından SAM dosyalarını BAM dosyalarına dönüştürülür.

SNP ve InDel Analizi

SNP’ler ve In Del tespitleri GATK4 ile işlenir ve açıklama ve sınıflandırma için Genoks tarafından geliştirilen bir analiz aracı kullanılır.

SV Analizi

Yapısal varyasyonlar, çift uçlu okumaları hizalarken genel SV analizini zorlaştırır, bu nedenle bu anormal okuma çiftlerini ve/veya SV’leri çağırmak için yumuşak klip okumaları kullanılır. Burada kullanılan analiz aracı Break Dancer’dır.

Kopya Sayısı (CNV) Analizi

Varyantların sonuçlarının anotasyonu, VEP ve ANNOVAR aracılığıyla yapılır.

  • DNA dizileri, hizalama sonuçlarına göre bazların dizi derinliğine göre bölümlere ayrılır.
  • P değeri, her bir parçanın bir CNV olma olasılığını tahmin etmek için hesaplanır.
  • Kriterleri geçen fragmanlar (2 kb'den uzun parça uzunluğu, P değeri <= 0,35 ve ortalama derinlik 0,5'ten az veya 2,0'dan büyük) CNV olarak tanımlanır.
stLFR Dizileme
stLFR Dizileme
stLFR Dizileme

Bizimle İletişime Geçmek İster Misiniz?