Transkriptom RNA Dizileme Hizmeti

Transkriptom RNA Dizileme Hizmet Tanımı

Transkriptom dizileme, belirli koşullar altında biyolojik bir numunede RNA’nın varlığını, miktarını ve yapısını ortaya çıkarmak için kullanılır. Mikrodizi analizi gibi hibridizasyon tabanlı RNA kantifikasyon yöntemleriyle karşılaştırıldığında, dizileme tabanlı transkriptom tespiti, gen ekspresyonunu düşük arka plan, yüksek doğruluk ve geniş bir dinamik aralık içinde yüksek düzeyde tekrarlanabilirlik ile ölçebilir.

Ayrıca transkriptom dizileme, mevcut bir genom dizisini gerektirmez ve mikrodiziler tarafından tespit edilemeyen mutasyonları, splice varyantlarını ve füzyon genlerini tespit edebilir.

Başlangıçtan sonuç raporlamasına kadar numunelerinize özen gösteriyoruz. Son derece deneyimli laboratuvar uzmanları, sonuçlarınızın bütünlüğünü sağlamak için sıkı ve önemli prosedürlerini takip eder. Genoks Teknoloji transkriptom dizileme hizmetleri, daha düşük maliyet ve sonuç süresiyle avantaj sağlamaktadır.

1. Total RNA İzolasyonu

Çalışılmak istenen canlı dokusundan total RNA izolasyonu yapılmalıdır. Örnek canlıya ve bu canlının hedef dokusuna göre özel izolasyon kitleri kullanılabilir. Daha sonra elde edilen RNA’nın kalitesi, Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent RNA 6000 Nano Kit) kullanarak tespit edilir.

2. RNA Deplesyonu

RNA dizileme için hedef RNA’ya göre deplesyon yapılmalıdır. mRNA ve lncRNA’lar benzer uzunlukta olduğu için aynı library ve sekans çipi ile çalışılabilirken, görece daha az baz çifti içeren miRNA’lar (small RNA) mRNA ve lncRNA’lar ile aynı library ve çip kullanılarak çalışmaya dahil edilemez ve ara işlem basamakları gerektirir. İş akışındaki ilk adım, poli-T oligoya bağlı manyetik boncuklar kullanarak poli-A içeren mRNA moleküllerinin saflaştırılmasını içerir.

3. Fragmantasyon

RNA deplesyonunun ardından, mRNA, yüksek sıcaklık altında iki değerli katyonlar kullanılarak küçük parçalara ayrılır. Bu işlem enzimle veya ses ile de yapılabilir.

4. cDNA Sentezi

Bölünmüş RNA fragmanları, ters transkriptaz ve rastgele primerleri kullanarak tek zincirli cDNA’ya çevirilir. Bunu DNA Polimeraz I ve RNase H kullanarak ikinci iplikçik cDNA sentezi izler.

5. Kütüphane Hazırlığı

Manyetik boncuklarla toplanan bu DNA parçalarının uçları onarılır (son onarım) ve 3′ uçlarına adenin eklenir. Bir sonraki adımda ligasyona temelli olarak fragmanlara adaptörler ve barkodlar eklenir ve ilk PCR adımı başlatılır.

6. Daireselleştirme

Standart teknolojilerin aksine, ikinci PCR aşaması, DNA’yı “daireselleştirme” adı verilen bir aşama ile yuvarlak bir zincire dönüştürerek aynı zincir üzerinde DNA Nanoball (DNB) oluşturur ve böylece PCR hatalarını en aza indirir. DNA’yı dairesel hale getirmek için bir splint oligo da kullanılır.

7. Dizileme Adımı

Oluşturulan her bir DNB, DNBSEQ G-400 dizileme platformundaki akış hücresindeki (Pattern Array) noktalara yerleştirilir. Akış hücresinde (Flow Cell) sekans işlemi gerçekleşir. Klasik dizileme yönteminde olduğu gibi, farklı boyalarla işaretlenmiş modifiye edilmiş dNTP’leri içeren reaksiyon çözeltisi akış hücresine yüklenir. DNBSEQ G-400 cihazı, cPAS veya CoolMPS teknolojisini kullanarak her Nanoball’daki bazların okunmasını sağlar.

Sekans Süreci

  • Primer bağlama ve dizileme solüsyonunun akış hücresine yüklenmesi
  • Primer sonrası bazın bağlanması
  • Görüntüleme
  • Ayrılma
  • Ortamdaki bağlı olmayan bazların kaldırılması

Dizileme Teknolojisi

cPAS dizileme teknolojisi, DNB üzerindeki DNA’ya floresansla modifiye edilmiş dNTP ekleyerek yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme prensibi üzerinde çalışır. CoolMPS dizileme teknolojisinde, dizileme floresan dNTP’ler ile değil, özel olarak tasarlanmış “antikorlar” ile yapılır. Her iki sekanslama teknolojisinde de sinyalizasyon artarken hata oranı azaltılır. DNBSEQ G-400 cihazında aynı anda 2 çip (Flow Cell) çalıştırarak, okumaya göre maksimum 1440 Gb (1,4TB) ‘ye kadar değişken ve yüksek veri çıkışı verebilir.

8. Biyoenformatik Analiz

Temiz okumaları elde etmek için ilk önce, düşük okuma değerlerininin, adaptör okumaları, bilinmeyen bazların okumaların (N bazları% 5’ten fazla) filtrelenmesi yapılır. Daha sonra bu temiz okumaları referans genomla karşılaştırıp ardından yeni gen tahmini, SNP & INDEL ve füzyon gen analizi yapılır. Son olarak, örnekler arasındaki farklı şekilde ifade (eksprese) edilmiş genleri tespit edilir ve kümeleme analizi ve işlevsel ek açıklamalar yapılır.

Transkriptom Sekanslama Prosedürü

İlk olarak, düşük kaliteli okumalar (%20 den fazlası 10’dan az kalite skoruna sahip fragmentler), adaptör içeren fragmentler, bilinmeyen baz içeren fragmentler (%5’ten fazla N içerenler) filtrelenir. Ardından bu okumalar, referans genoma hizalanır ve özgün gen analizi yapıldı. Ardından da kümeleme ve fonksiyonel annotasyon işlemleriyle görselleştirmeler yapılır.

Hizalama

Hizalama işlemi HISAT2 (Hierarchical Indexing for Spliced Alignment of Transcripts) ile yapılır. HISAT2 RNA-Seq verisetleri için hassas bir hizalama olanağı sağlar.

SNP ve InDel Analizi

SNP ve INDEL analizleri GATK4 kullanılarak, “Best Practices” iş akışının uygulanmasıyla elde edilmiştir.

Özgün Transkript Analizi

Tekrarı olmayan RNA-seq projelerinde, gen ekspresyonu analizi R programlama dili kullanılarak, görselleştirilmekte ve analiz edilmektedir.

Gen Ontoloji ve Yolak Analizi

Yolak analizleri, R programlama diliyle yazılmış olan paketler ve GO ve KEGG veritabanları kullanılarak yapılmaktadır.
3612696

Bizimle İletişime Geçmek İster Misiniz?