Tüm Ekzom Dizileme Hizmeti
Tüm Ekzom Dizileme Hizmet Tanımı
Ekzom dizileme, insan genomunun kodlama bölgeleri içindeki ekzonların çoğaltılması ve yüksek verimli dizileme yoluyla potansiyel varyasyonlardan kaynaklanan mutasyonların analizini sağlar.Tüm ekzom dizilemenin en büyük avantajı, gelişmiş analiz ve raporlama yoluyla genetik bozukluklardan sorumlu varyantları tanımlamak için klinik tanıya yardımcı olan basit ve uygun maliyetli bir yaklaşım sunmasıdır.
Yeni Nesil Dizileme teknolojisi ile 22.000’den fazla geni 180.000’den fazla ekzonu tarayarak Mendeliyen ve karmaşık hastalıklara yol açabilecek genetik mutasyonları araştırmak mümkündür.
Başlangıçtan sonuç raporlamasına kadar numunelerinize özen gösteriyoruz. Son derece deneyimli laboratuvar uzmanları, sonuçlarınızın bütünlüğünü sağlamak için sıkı kalite prosedürlerini takip eder.
1. DNA İzolasyonu
Öncelikle çalışmak istediğimiz organizmanın dokusuna ait numuneden DNA izole edilmelidir. Bunun için numune materyaline göre özel izolasyon kitleri kullanılır. Daha sonra elde edilen DNA’nın kalitesinin ölçümü “Qubit” cihazı ile yapıldıktan sonra bir sonraki adım olan fragmantasyon aşamasına geçilebilir.2. Fragmantasyon
Nitelikli DNA örnekleri, numune kalitesinden (QC) sonra enzimatik olarak rastgele parçalanır. Parçaların uzunlukları, ileride yapılacak olan dizileme aşamasında çift veya tek yönlü okuma uzunluğuna göre hesaplanmalı ve çalışma için özel olarak optimize edilmelidir. Bu fragmanların kalite kontrolü “Bioanalyzer” cihazı ile yapılmaktadır.3. Kütüphane Hazırlığı
Manyetik boncuklarla toplanan bu DNA parçalarının uçları onarılır (son onarım) ve 3′ uçlarına adenin eklenir. Bir sonraki adımda ligasyona temelli olarak fragmanlara adaptörler ve barkodlar eklenir ve ilk PCR adımı başlatılır.Bağlanmamış fragmanlardan kurtulmak için, ilk PCR aşaması yapıldıktan sonra bir saflaştırma yapılır. Zenginleştirme için 36 MB hedef bölgeli yakalama kiti ile hibridizasyon yapılır, daha sonra hibridize olmayan fragmanlar yıkanır ve ikinci PCR adımı başlatılabilir. Standart teknolojilerin aksine, ikinci PCR aşaması, DNA’yı “daireselleştirme” adı verilen bir aşama ile yuvarlak bir zincire dönüştürerek aynı zincir üzerinde DNA Nanoball (DNB) oluşturur ve böylece PCR hatalarını en aza indirir. DNA’yı dairesel hale getirmek için bir splint oligo da kullanılır.
4. Dizileme Adımı
Oluşturulan her bir DNB, DNBSEQ G-400 dizileme platformundaki akış hücresindeki (Pattern Array) noktalara yerleştirilir. Akış hücresinde (Flow Cell) sekans işlemi gerçekleşir. Klasik dizileme yönteminde olduğu gibi, farklı boyalarla işaretlenmiş modifiye edilmiş dNTP’leri içeren reaksiyon çözeltisi akış hücresine yüklenir. DNBSEQ G-400 cihazı, cPAS veya CoolMPS teknolojisini kullanarak her Nanoball’daki bazların okunmasını sağlar.
Sekans Süreci
Dizileme Teknolojisi
cPAS dizileme teknolojisi, DNB üzerindeki DNA’ya floresansla modifiye edilmiş dNTP ekleyerek yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme prensibi üzerinde çalışır. CoolMPS dizileme teknolojisinde, dizileme floresan dNTP’ler ile değil, özel olarak tasarlanmış “antikorlar” ile yapılır. Her iki sekanslama teknolojisinde de sinyalizasyon artarken hata oranı azaltılır. DNBSEQ G-400 cihazında aynı anda 2 çip (Flow Cell) çalıştırarak, okumaya göre maksimum 1440 Gb (1,4TB) ‘ye kadar değişken ve yüksek veri çıkışı verebilir. Ortalamada; Araştırma amaçlı tüm genom sekanslama çalışmaları için 10X sekanslama derinliği yeterliyken, klinik tanı gerektiren bir çalışma için >30X sekanslama derinliği önerilir.
5. Biyoenformatik Analiz
Biyoinformatik analiz, sekanslama sonucunda üretilen ham verilerle başlar. Verilerin anlamlı hale getirilmesi ile, grup içi örneklerin karşılaştırılması, deneydeki örneklerin veri tabanları ile karşılaştırılması, popülasyonlara göre dağılımı gibi analizleri içerir.Filtreleme
İlk başta, bu okumalardan adaptör okumaları ve düşük kaliteli okumalar çıkarılır. Bundan sonra ortaya çıkan verilere temiz veri denilir.Hizalama
Okumalar daha sonra Burrows-Wheeler Aligner (BWA) ile referans genom ile hizalanır. Hizalama sonucunda oluşturulan SAM (Squence Aligned Map) dosyaları BAM (Binary Aligned Map) formatına dönüştürülerek bu formda saklanır ve oluşturulan SAM dosyaları silinerek yer tasarrufu sağlanır. Oluşturulan veriler üzerinde gerekli filtreler (Picard Tools) yapılır ve duplike okumalar işaretlenir. Bu adımdan sonra, BAM dosyaları varyant tespiti için hazırdır.SNP ve InDel Analizi
SNP’ler ve In Del tespitleri GATK4 ile işlenir ve açıklama ve sınıflandırma için Genoks tarafından geliştirilen bir analiz aracı kullanılır.SV Analizi
Yapısal varyasyonlar, çift uçlu okumaları hizalarken genel SV analizini zorlaştırır, bu nedenle bu anormal okuma çiftlerini ve/veya SV’leri çağırmak için yumuşak klip okumaları kullanılır. Burada kullanılan analiz aracı Break Dancer’dır.Kopya Sayısı (CNV) Analizi
Varyantların sonuçlarının anotasyonu, VEP ve ANNOVAR aracılığıyla yapılır.
